Le continue incursioni del conquistatore spagnolo Don Nuño Beltrán de Guzmán verso le terre occidentali del paese, al fine di aumentare il suo dominio e potere su quei territori, portarono alla creazione di una nuova provincia chiamata Regno della Nuova Galizia.
La regione era abitata da vari gruppi indigeni, che devastarono continuamente gli insediamenti che gli spagnoli vi avevano fondato. Il luogotenente di Nuño de Guzmán, il capitano Juan B. de Oñate ricevette l'ordine di pacificare quelle province e di fondare la Villa de Guadalajara nel luogo chiamato Nochistlán, un fatto che portò a termine il 5 gennaio 1532. In vista dei frequenti attacchi indigeni alla città dovette trasferirsi un anno dopo a Tonalá e poi a Tlacotlán. Un terzo trasferimento fu effettuato per insediare la città nella valle di Atemajac, dove la città fu fondata definitivamente il 14 febbraio 1542 con la presenza di Cristóbal de Oñate come governatore di Nueva Galicia e Don Antonio de Mendoza, poi viceré della Nuova Spagna, che nominò sindaco e luogotenente governatore Miguel de Ibarra.
La città si sviluppò rapidamente e iniziò a competere con quella di Compostela (oggi Tepic), che allora era la sede dei poteri religiosi e civili, tanto che gli abitanti di Guadalajara esercitarono una tale pressione sulle autorità dell'Audiencia, che il re Felipe II decise di emettere una Cedula datata 10 maggio 1560 per trasferirsi da Compostela a Guadalajara, la Cattedrale, la Corte Reale e gli ufficiali del Tesoro.
La struttura urbana è stata pianificata secondo quella delle altre città coloniali, quindi il suo layout è stato sviluppato a forma di scacchiera da quella che era la piazza San Fernando. Successivamente i quartieri di Mexicaltzingo e Analco furono fondati da Fray Antonio de Segovia, e il quartiere di Mezquitán, uno dei più antichi. Furono costruite anche le case del municipio, di fronte all'attuale tempio di San Agustín e alla prima chiesa parrocchiale dove si trova il Palazzo di Giustizia.
Oggi, la magnifica città, ricca di edifici coloniali, espone un buon numero di esempi architettonici rilevanti, come la sua Cattedrale, un sito imperdibile, costruita tra il 1561 e il 1618 dall'architetto Martín Casillas. Il suo stile è stato classificato come barocco incipiente. La sua solida struttura sorge di fronte all'odierna Plaza de Guadalajara, con le sue curiose torri che, sebbene non appartengano allo stile originale dell'edificio, sono attualmente riconosciute come un simbolo della capitale di Guadalajara. Le torri primitive furono distrutte nel XIX secolo da un terremoto, motivo per cui furono aggiunte quelle che ha oggi. L'interno del tempio è in stile semi-gotico, comprese le volte in pizzo.
Altri recinti religiosi del XVI secolo sono il convento di San Francisco, fondato nel 1542 vicino al fiume, nel quartiere di Analco, e quasi totalmente distrutto durante la Riforma. Il suo tempio, ristrutturato alla fine del XVII secolo, con la sua facciata barocca di modeste linee salomoniche, è conservato. Il convento di San Agustín, fu fondato nel 1573 dall'ordinanza reale di Filippo II e attualmente conserva il suo tempio con la sua facciata di severe linee herreriane e il suo interno con volte a vela.
Santa María de Gracia, un'altra delle fondazioni conventuali, fu occupata dalle suore domenicane di Puebla, costruita nel 1590 di fronte alla Plaza de San Agustín e pagata da Hernán Gómez de la Peña. La costruzione arrivò ad occupare sei blocchi, anche se oggi rimane solo il suo tempio, con una facciata neoclassica della seconda metà del XVIII secolo.
